Ce document a pour objectif de proposer les données toxicologiques minimales à acquérir et à évaluer avant l'administration, pour une durée donnée, d'un médicament chez l'homme. Il reprend les dernières recommandations élaborées dans le cadre d'ICH* (cf références 1 à 10). Les indications contenues dans ce texte ne sont pas contraignantes et doivent être adaptées aux circonstances de l'essai clinique.

Toutes les études doivent être effectuées conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire (cf référence 11).

* International Conference on Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use: Conférence regroupant les Etats-Unis, I'Union Européenne et le Japon et visant à élaborer des recommandations harmonisées entre ces 3 régions pour les exigences portant sur la qualité, la securité, et l'efficacité des médicaments à usage humain destinés à être mis sur le marché. Après accord, ces recommandations complètent ou remplacent officiellement les exigences de ces 3 régions.

L'exploration de la pharmacodynamie du médicament chez l'animal est un préalable indispensable à l'initiation des essais cliniques. La pharmacologie de sécurité consiste à explorer au minimum l'effet du produit sur les systèmes nerveux central, cardio-vasculaire et respiratoire. En cas de doute lié à la classe du médicament ou aux données déjà accumulées sur le produit en cours d'évaluation, il pourra être procédé à des compléments d'études de pharmacodynamie rénale, gastro-intestinale, du système immunologique ou de tout autre organe ou système suggéré. (référence 1)

Préalablement à l'initiation d'un essai clinique de phase I, devront être disponibles des données de toxicocinétique (références I et 2). Ces données consistent à obtenir, notamment au cours des études de toxicité précliniques ou au cours d'études spécifiques, des données de pharmacocinétique permettant d'apprécier l'exposition systémique adéquate des animaux en fonction des doses testées et de la durée de l'étude. Elles aideront à l'interprétation des observations toxicologiques et à l'évaluation de leur pertinence clinique. Elles permettent d'orienter le choix des espèces et des modalités de traitement et par conséquent la conduite d'autres études de toxicité préclinique. L'obtention de données de toxicocinétique est utile au cours des études de toxicité par administration unique et réitérée, des études de reproduction, de génotoxicité et de carcinogénicité. Des données complémentaires de pharmacocinétique concernant l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion du produit chez l'animal seront également nécessaires préalablement aux essais de phase II afin notamment de pouvoir comparer le métabolisme chez l'homme et l'animal.
 

L'intérêt de ces tests est d'orienter la préparation des protocoles de toxicité animale en administration réitérée et de fournir des données utiles à l'usage clinique en cas d'intoxication aiguë.

La toxicité animale en administration unique devra être faite avant toute administration à l'homme. On pourra utiliser comme alternative à cette méthode une approche en doses croissantes (référence 1)

L'objectif est d'évaluer, si possible, la DL50 ainsi que la dose sans effet létal. Cependant la détermination exacte de la DL50 n'est plus requise. La tolérance ne sera pas seulement jugée sur la survie ou la mort des animaux, mais aussi sur des critères cliniques (évolution pondérale, activité motrice, état tégumentaire,...). L'observation des animaux dure habituellement 14 jours.

Les animaux survivants devront être sacrifiés à l'issue de cette période pour examen macroscopique des viscères. Au moindre doute à la nécropsie, un examen histopathologique devra être réalisé. Dans certains cas, des examens biologiques pourront être pratiqués. La dose maximale sans effet toxique sera la dose la plus élevée pour laquelle aucun effet toxique significatif clinique, biologique ou anatomopathologique n'aura été relevé par rapport au(x) lot(s) d'animaux témoins.

Ces essais doivent être menés chez deux espèces de mammifères ( habituellement la souris et le rat ), par deux voies d'administration : la voie d'utilisation clinique et la voie offrant la meilleure biodisponibilité connue (intraveineuse, intrapéritonéale,...). Si la voie d'utilisation clinique développée est intraveineuse, les études de toxicologie pourront n'être menées qu'avec cette dernière voie d'administration. De plus, un essai allégé est généralement effectué chez le chien pour rechercher la dose maximale tolérée (dose qui provoque un effet toxique minime mais qui n'affecte pas la survie des animaux) ou la dose maximale sans effet toxique.
 

Les études de toxicologie en administration réitérée doivent être menées sur au moins deux espèces animales mammifères dont une non-rongeur. Le rongeur le plus souvent utilisé est le rat. Le choix de la deuxième espèce est de préférence orienté par les données déjà acquises sur la pharmacocinétique du produit en cours d'évaluation. En effet, la deuxième espèce animale choisie devra, dans la mesure du possible, présenter un profil cinétique proche de l'homme (chien, singe,...). Dans le cas où aucune donnée de pharmacocinétique humaine n'est disponible, il pourra être procédé à une première administration à l'homme en dose unique après des études de toxicologie réitérée chez le rat et le chien. Notons enfin que les différences métaboliques entre les animaux et l'homme sont plus souvent quantitatives que qualitatives.

La voie d'administration doit, en principe, être celle de l'utilisation clinique. Habituellement, trois doses sont utilisées:

- une dose faible, correspondant à 2 à 3 fois la posologie clinique rapportée au poids corporel ou à la surface corporelle des animaux et corrigée si nécessaire en cas de biodisponibilités différentes entre l'animal utilisé et l'homme
(posologies "AUC équivalentes");

- une dose forte, devant en principe provoquer un ou plusieurs effets toxiques;

- une dose moyenne ou moyenne géométrique des deux doses précédentes.

En phase I & II, la durée tolérée d'utilisation du médicament chez l'homme sera au plus égale à la durée maximale d'administration du médicament chez l'animal (référence 1).

durée de l'exposition animale		durée tolérée d'exposition humaine
rongeur	non rongeur
< 2 semaines	< 2 semaines	Dose unique
2 semaines	2 semaines	jusqu'à 2 semaines
1 mois	1 mois	jusqu'à 1 mois
3 mois	3 mois	jusqu'à 3 mois
6 mois	6 mois	jusqu 'à 6 mois
6 mois	> 6 mois  *	> 6 mois

* Durée d'exposition au moins équivalente à la durée d'exposition clinique (dans la limite de neuf mois).(référence3)

Les études de toxicologie réitérée doivent permettre de préciser l'existence d'organes cibles et par ailleurs, comme en toxicologie aiguë, la dose maximale sans effet toxique en prises répétées. Cette tolérance sera appréciée sur des critères cliniques (comportement, poids, croissance,...), biologiques (hématologie, biochimie,...) et, après sacrifice, par l'examen macroscopique des principaux viscères, leur pesée, et l'examen histologique des différents organes ( une quarantaine d'organes est en principe examinée). Il est opportun de prévoir durant ces études des examens ophtalmologiques et électrocardiographiques (chien). Une étude de toxicocinétique sera nécessaire afin de s'assurer du passage systémique du produit, d'une exposition suffisante des animaux ( Cmax, AUC,...), et d'apprécier les métabolites permettant de juger de la pertinence de l'espèce animale choisie. Des études de distribution tissulaire en doses répétées sont nécessaires dans certaines circonstances particulières ( ex: demi-vie d'élimination tissulaire > demi-vie d'élimination plasmatique ).
 

La tolérance locale doit être étudiée chez l'animal en utilisant la voie d'administration la plus pertinente compte-tenu de la voie d'administration clinique. Son évaluation doit etre réalisée préalablement aux essais de phase I et peut être effectuée au cours des études de toxicité (référence 1).
 

Ces essais ont pour objectif de rechercher une éventuelle potentialité mutagène ou clastogène de la molécule.

Avant toute administration à l'homme, au minimum 2 tests in vitro sont requis (références 1 et 4) :

- 1 test de mutation génique,
- 1 test d'aberrations chromosomiques.

En cas de résultat douteux ou positif d'un des tests ou préalablement aux essais de phase II, la réalisation de la batterie standard de 3 tests est requise (référence 5):

- 1 test de mutation génique sur bactéries (ex: test d'Ames)
- 1 test d'aberrations chromosomiques in vitro sur cellules de mammifères (ex: sur Iymphocytes humains ) ou un test in vitro sur Iymphome murin (ex : Mouse Lymphoma tk assay ( MLA)).
- 1 test d'aberrations chromosomiques in vivo sur cellules hématopoiétiques de rongeur ( ex: test du micronucleus). Une preuve d'exposition si la voie d'administration n'est pas la voie veineuse est indispensable.

Dans certaines situations, la batterie standard des 3 tests pourra nécessiter une adaptation:

- En effet, la réalisation du test de mutation génique sur bactéries est limitée lors de l'utilisation de produits toxiques pour la bactérie (tels que les antibiotiques) ou de composés interférant avec le système de réplication des cellules de mammifères ( ex: inhibiteurs des topoisomérases, inhibiteurs du métabolisme de l'ADN ). Dans ce cas, le résultat de ce test devra tout de même être présenté mais 2 autres tests in vitro (1 test d'aberrations chromosomiques et 1 test de mutation génique ) sur cellules de mammifères utilisant 2 types cellulaires différents seront demandés.

- Des composés ayant une structure d'alerte et ayant donné des résultats négatifs aux 3 tests standards peuvent nécessiter des tests supplémentaires ou des modifications de protocole qui dépendront alors de la nature chimique, de la réactivité et du métabolisme du produit.

- La réalisation de tests in vivo est limitée pour des composés qui ne sont pas absorbés ( ex: antiacides, produits radiopharmaceutiques ). Dans ce cas, si une modification de la voie d'administration ne fournit pas une exposition suffisante des tissus cibles, l'évaluation ne se fera que sur la base des tests in vitro.

- Si une réaction négative a été observée sur la batterie habituelle des 3 tests de génotoxicité pour un produit ayant clairement montré des propriétés cancerogènes, d'autres tests in vitro ou in vivo pourraient s'avérer nécessaires pour la compréhension du mécanisme d'action (ex.: UDS test...)
 

Les résultats des études de cancérogenèse ne sont généralement pas requis avant la conduite d'un essai sauf en cas de signes d'appels :

- d'analogie chimique du produit étudié ou d'un ou de plusieurs de ses métabolites avec des substances cancérogènes connues;
- d'images histologiques suspectes en toxicologie réitérée;
- d'accumulation du produit dans un ou des tissus réservoirs (ex. médicaments lipophiles et tissus adipeux, tétracyclines et os,...).

(références 1 et 6)

 

Le schéma de base consiste à réaliser une étude de cancérogenèse à long terme chez le rongeur. Le choix de l'espèce est basé sur des critères pharmacologiques, toxicologiques ( doses répétées), métaboliques ou sur des particularités liées à la voie d'administration. Sauf cas particulier, l'espèce de choix est le rat. Cette étude est complétée par une étude additionelle qui peut être:

- une étude à long terme chez une deuxième espèce de rongeur. Cette approche est encore considérée comme acceptable.

- une étude à court ou moyen terme chez le rongeur ( modèles néonataux ou transgéniques, ou initiation promotion). Ces méthodes alternatives sont actuellement en développement. (référence 7)

En cas de résultats positifs, une étude mécanistique sera utile : explorations hormonales, enzymatiques, génotoxiques.

La durée de traitement des animaux est habituellement de 24 à 30 mois chez le rat et de 18 à 24 mois chez la souris. Dans tous les cas, en pratique l'étude devrait être arrêtée lorsque le nombre d'animaux par groupe atteint le chiffre de 20. Généralement, 3 doses sont utilisées ( dose faible, moyenne et forte ). La dose maximale est choisie de telle sorte qu'elle ne s'accompagne pas d'une perte de poids supérieure à 10% et n'entraîne pas de mortalité incompatible avec la survie d'un nombre suffisant d'animaux à l'issue de la période de traitement. Cette dose est estimée à partir des études de toxicologie réitérée sur 90 jours. La voie d'administration testée doit être, si possible, identique à celle utilisée en thérapeutique. Une étude de toxicocinétique sur des lots satellites est nécessaire surtout lorsque le produit à tester est administré dans la nourriture.
 

Jusqu'à une époque relativement récente, I'étude des fonctions de reproduction se divisait en trois segments:

- segment I: étude de la fertilité chez le rat par traitement des deux géniteurs, leur descendance étant non traitée;
- segment II: étude d'embryofoetotoxicité et de tératogénèse sur deux espèces dont une non rongeur;
- segment III: étude de la toxicité péri et post natale chez le rat ( mise bas et allaitement )

Actuellement, le cycle de vie de la conception à la maturité sexuelle a été divisé en six stades successifs. Pour étudier ces six stades, 3 types d'études ont été développées:

- fertilité et développement embryonnaire précoce jusqu'à implantation (sur une espèce de rongeur)
- développement embryo-foetal (sur une espèce de rongeur et de non rongeur)
- développement pré et post natal (sur une espèce de rongeur)

 a. Les femmes (références I et 8)

Aucune étude de toxicologie de la reproduction ne sera requise pour les femmes non fertiles ( ménopause, stérilité chirurgicale (ex.ligature des trompes),...) à condition que lors des études de toxicité par administration réitérée, I'examen des organes reproducteurs femelles ait été réalisé.

Préalablement aux essais de phase I, I'inclusion dans un essai de femmes fertiles sous contraceptifs devra être précédée d'une étude de développement embryo-foetal. Avant leur inclusion dans un essai de phase III, une étude supplémentaire de fertilité et de développement embryonnaire précoce sera demandée.

En plus de ces études, il sera demandé pout tout essai clinique préalablement à l'inclusion de femmes fertiles n'utilisant pas de moyen de contraception ou n'ayant pas effectué de test de grossesse préalablement, des études de développement pré et post natal ainsi que les résultats des études de génotoxicité.

L'inclusion de femmes enceintes dans un essai ne sera possible qu'après réalisation de toutes les études de toxicité sur les fonctions de reproduction, de la batterie standard des trois tests de mutagenèse et d'une étude de pharmacologie de sécurité humaine.

 b. Les hommes (références l, 8 et 9)

Les études de toxicologie animale réitérée s'accompagnent systématiquement d'une histologie des gonades, chez les males comme chez les femelles. L'examen doit, non seulement, porter sur les testicules (spermatogénèse), mais aussi sur les glandes annexes (prostate, vésicules séminales).

L'inclusion d'hommes dans un essai clinique de phase I ou II sera possible, sans étude de fertilité, si les études de toxicité par administration réitérée n'ont montré aucune anomalie histologique de l'appareil génital mâle.

Pour les essais cliniques de phase III, une étude de fertilité préalable sera nécessaire.

 X - Prérequis spécifiques aux essais cliniques chez l'enfant

Lors d'essais cliniques, l'administration de médicaments à des enfants doit, au minimum, répondre aux mêmes prérequis que ceux exigés pour les adultes. Des études chez le jeune animal peuvent être nécessaires notamment lorsque les données de sécurité chez l'homme ou les autres études animales sont insuffisantes.

Par ailleurs, il est recommandé de n'inclure d'enfants dans un essai clinique qu'après achèvement de toutes les études de toxicologie animale nécessaires à une utilisation thérapeutique chez l'adulte ou mieux, chaque fois que cela sera possible, après exposition d'adultes en pratique clinique courante.

Pour des essais cliniques à long terme, des études de cancérogenèse seront nécessaires préalablement à l'exposition d'enfants lorsque le traitement est destiné à être administré durant une longue période ou en cas de signes d'alerte.

Les prérequis toxicologiques recommandés pour les produits chimiques ne sont pas transposables pour les produits issus des biotechnologies. Il semble difficile de définir de façon précise les prérequis spécifiques à ces médicaments. En effet, l'évaluation de leur sécurité se fait actuellement par une approche scientifique adaptée au cas par cas à chaque produit.

Leur nature peut influencer la conduite ou le protocole expérimental de certaines études:

- Par exemple, les essais de toxicité sur les fonctions de reproduction doivent être adaptés en fonction d'éventuelles spécificités d'espèces ou de l'antigénicité du produit testé.

- De même, la batterie standard des tests de génotoxicité n'est pas adaptée à l'évaluation des produits issus des biotechnologies puisque les peptides ne sont pas susceptibles d'interagir avec l'ADN.

- Enfin, les tests évaluant la cancérogenèse d'un produit d'origine chimique ne sont pas transposables pour les produits issus des biotechnologies.

L'évaluation préclinique de la sécurité de ces produits doit être effectuée dans deux espèces pertinentes. Cette pertinence se juge sur la base des résultats d'études in vitro et in vivo afin de déterminer, en comparaison avec l'homme, I'activité pharmacologique du produit chez l'animal. Lorsqu'une espèce animale ne répond à ces critères, il est alors conseillé:

- d'utiliser des modèles animaux de la maladie constituant l'indication thérapeutique du produit
- de ne réaliser que des études de toxicité de durée limitée (14 jours ou moins ) en incluant la surveillance des effets fonctionnels.

De nombreux produits biologiques sont potentiellement immunogènes chez l'animal. L'apparition d'anticorps neutralisants doit être suivie au cours des études de toxicité par administration réitérée afin d'aider à l'interprétation des effets pharmacologiques ou toxiques.

1- ICH Guideline M3 : Non-Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals - CPMP/ICH/286/95.

2 - ICH Guideline S3A : Toxicokinetics : A Guidance for Assessing Systemic Exposure in Toxicology Studies CPMP/ICH/384/95.

3 - ICH Guideline S4A : Duration of Chronic Toxicity Testing in Animals (Rodent and Non Rodent Toxicity Testing) - CPMP/ICH/300/95.

4 - ICH Guideline S2A : Genotoxicity: Specific Aspects of Regulatory Genotoxicity Tests for Pharmaceuticals -CPMP ICH/141 /95.

5 - ICH Guideline S2B : Genotoxicity: A Standard Battery for Genotoxicity Testing of Pharmaceuticals - CPMP ICH/174/95.

6 - ICH Guideline S1A : Guideline on the Need for Carcinogenicity Studies for Pharmaceuticals -
CPMP ICH/140/95.

7 - ICH Guideline S1B : Carcinogenicity : Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals -
CPMP/ICH/299/95

8 - ICH Guideline S5A : Reproductive Toxicology : Detection of Toxicity to Reproduction for Medicinal Products - CPMP ICH/386/95.

9 - ICH Guideline S5B : Reproductive Toxicology : Toxicity to Male Fertility - CPMP ICH/136/95.

10 - ICH Guideline S6 : Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals - CPMP/ICH/302/95.

I l - Bonnes Pratiques de Laboratoire- Arrêté du 20 janvier 1986

lnstruction du 3 septembre 1984 relative à la conduite d'une inspection dans le domaine de la toxicologie expérimentale.

O.C.D.E: Décision du conseil relative à l'acceptation mutuelle des données pour l'évaluation des produits chimiques adoptée lors de la 912ème session, le 26 novembre 1997.